在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，因而細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中被支原體污染是一個(gè)世界性的難題。細(xì)胞培養(yǎng)中常遇見(jiàn)的有細(xì)菌污染、真菌污染、支原體污染、病毒污染等。說(shuō)起支原體污染，估計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)的同學(xué)就開(kāi)始犯愁了，細(xì)胞培養(yǎng)的老手都知道，支原體污染非常不易察覺(jué)。有的實(shí)驗(yàn)室被支原體污染后，如果不進(jìn)行有效*的支原體清除，該實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)很難進(jìn)行下去，細(xì)胞傳代3代以后狀態(tài)就急劇下滑，無(wú)法進(jìn)行正常實(shí)驗(yàn)，有的實(shí)驗(yàn)室甚至只能指望換細(xì)胞間。那么怎樣才能有效檢測(cè)并清除支原體污染呢?

支原體污染的來(lái)源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)的污染、污染支原體的細(xì)胞造成的交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來(lái)的污染和用來(lái)制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染。細(xì)胞培養(yǎng)工作中，主要從以下幾個(gè)方面來(lái)預(yù)防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)操作；細(xì)胞培養(yǎng)和器材要保證無(wú)菌；在細(xì)胞培養(yǎng)中加入適量的抗生素。

據(jù)了解，抗生素不能*根zhi支原體感染，停藥后一段時(shí)間可以復(fù)發(fā)。因此，本文著重講述細(xì)胞支原體污染預(yù)防之支原體快速檢測(cè)和環(huán)境空間消毒方案，從根本入手預(yù)防解決細(xì)胞培養(yǎng)支原體污染問(wèn)題。

1、支原體檢測(cè)

市場(chǎng)上支原體檢測(cè)方案琳瑯滿目，我們?cè)谧黾?xì)胞培養(yǎng)時(shí)肯定不想在支原體檢測(cè)上花費(fèi)一天的時(shí)間，哪種方案最為快速有效？在這兒介紹一種可以在30分鐘內(nèi)完成支原體檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒是由我國(guó)蘇州先達(dá)基因公司研發(fā)的，其原理是基于公司自主開(kāi)發(fā)的實(shí)時(shí)熒光恒溫核酸檢測(cè)技術(shù)（ERA），可以在恒定的低溫下（25℃-42℃）對(duì)痕量的支原體種內(nèi)保守性DNA片段進(jìn)行特異性的擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)可以在20min內(nèi)完成，該試劑盒檢測(cè)范圍涵蓋130種支原體。

ERA核酸擴(kuò)增技術(shù)的核心是一套等溫核酸擴(kuò)增組合酶制劑。通過(guò)酶工程改造，將來(lái)源于細(xì)菌和病毒的特定工具酶進(jìn)行改造突變并篩選其功能，通過(guò)不同的DNA擴(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化組合，從而獲得8種酶蛋白為核心的等溫?cái)U(kuò)增體系。配好的反應(yīng)體系在各種實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x或者先達(dá)基因自主研發(fā)的簡(jiǎn)易恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀中，可實(shí)現(xiàn)恒溫?cái)U(kuò)增與熒光信號(hào)檢測(cè)于一體，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線在20min內(nèi)就可通過(guò)檢測(cè)儀的顯示屏讀出檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)過(guò)程無(wú)需開(kāi)蓋，避免氣溶膠的產(chǎn)生，結(jié)果可靠性大幅度提高。ERA結(jié)合先達(dá)基因提供的一步法提取DNA的試劑，進(jìn)一步簡(jiǎn)化了支原體檢測(cè)操作，5min完成細(xì)胞液的DNA提取，20min完成支原體DNA分子檢測(cè)，整個(gè)過(guò)程只需30min。

2、環(huán)境空間消毒方案

環(huán)境空間消毒包括：環(huán)境空氣消毒、物體表面消毒、生物安全柜或超凈工作臺(tái)滅菌及培養(yǎng)箱消毒。目前大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)室只是簡(jiǎn)單安裝了臭氧消毒機(jī)，而從建立使用到后期從來(lái)沒(méi)有經(jīng)過(guò)大消毒（熏蒸滅菌），這給細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境微生物污染帶來(lái)了極大的隱患和風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)槌粞跸灸芰τ邢薏环€(wěn)定而且不能全面覆蓋，無(wú)法殺滅微生物休眠體，單純的臭氧消毒已不能深入的解決環(huán)境微生物問(wèn)題，只能說(shuō)是一種微生物水平控制的輔助手段。根據(jù)美國(guó)FDA、新版GMP及相關(guān)國(guó)際組織，現(xiàn)行的主流無(wú)菌室環(huán)境空間消毒是H2O2氣體滅菌，環(huán)保無(wú)毒無(wú)殘留，安全又快速。H2O2氣體滅菌應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)室消毒代替甲醛熏蒸將成為未來(lái)趨勢(shì)。

H2O2干霧氣體能快速殺滅細(xì)菌、真菌、支原體及病毒，法國(guó)歐菲姆H2O2干霧滅菌新技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)室環(huán)境消毒則更具創(chuàng)新性和實(shí)用適用價(jià)值。

環(huán)境及人員操作污染風(fēng)險(xiǎn)大，干霧滅菌方法能把這種污染風(fēng)險(xiǎn)降至低，其靈活消毒的特點(diǎn)更能為微生物防控提供有力支撐，細(xì)胞房環(huán)境、培養(yǎng)箱等均可輕松進(jìn)行滅菌處理而無(wú)需再投入過(guò)多的人力和物力，平常消毒及應(yīng)急消毒可謂獨(dú)yi無(wú)二。

法國(guó)歐菲姆H2O2干霧滅菌器源于歐盟GMP設(shè)計(jì)，自身符合潔凈區(qū)凈化要求，不帶入任何外源污染的同時(shí)高效治療潔凈室空間微生物，達(dá)到無(wú)菌凈化的目標(biāo)。采用了先進(jìn)的霧化技術(shù)，霧化顆粒小于3微米，增效了空間擴(kuò)散均勻性，迅速?gòu)浡錆M整個(gè)密閉空間不放過(guò)每一處死角，滅菌效果堪稱空qian絕hou，其均勻性、無(wú)殘留及對(duì)機(jī)器無(wú)傷害特征非常吻合細(xì)胞房環(huán)境消毒及培養(yǎng)箱里面消毒。

歐菲姆干霧H2O2滅菌器源于歐洲法國(guó)，專門(mén)針對(duì)潔凈廠房無(wú)菌室GMP設(shè)計(jì)，適應(yīng)大空間滅菌，小空間滅菌更靈活。采用了先進(jìn)霧化技術(shù)，霧化粒徑平均達(dá)到3—5微米，配合空間殺孢子劑使用，滅菌效果能對(duì)嗜熱脂肪桿菌芽孢降低6個(gè)對(duì)數(shù)值。

歐菲姆原理：歐菲姆采用獨(dú)到而特殊的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，使得在僅僅輸入電能的情況下，集壓縮、ventur噴射和霧滴內(nèi)外部濺射碎化功能于一體，使專用液態(tài)殺孢子劑變成氣霧狀態(tài)極微小顆粒噴出，高速極小微粒與空氣接觸后充分氣化，變成氣態(tài)H2O2即為“干霧"。

深圳潤(rùn)聯(lián)利用歐菲姆H2O2干霧滅菌器，針對(duì)不同行業(yè)的實(shí)驗(yàn)室以及醫(yī)療機(jī)構(gòu)，會(huì)提出不同環(huán)境消毒控制經(jīng)驗(yàn)，無(wú)論是P3實(shí)驗(yàn)室，無(wú)菌制劑生產(chǎn)車間，SFP動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，深圳潤(rùn)聯(lián)均有針對(duì)所在行業(yè)的具體空間消毒方案。

德國(guó)MB生產(chǎn)的Mycoplasma-offTM噴霧劑，或濕巾擦拭 5-10分鐘清除，對(duì)支原體、細(xì)菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無(wú)殘留, 無(wú)腐蝕, 無(wú)致癌性，操作簡(jiǎn)單方便。

qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對(duì)支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記，使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號(hào)的變化和配套軟件，進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，簡(jiǎn)稱qPCR。

優(yōu)點(diǎn)：①靈敏度高、特異性強(qiáng)。

②時(shí)間短，2-3小時(shí)出結(jié)果。

③檢測(cè)結(jié)果可定量。

④操作簡(jiǎn)便。

缺點(diǎn)：①對(duì)于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。（可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。